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嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是使用最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其微生物質(zhì)量控制一直是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施管理者的工作重點(diǎn)。每個(gè)設(shè)施都有自己的動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)方案，其中哨兵鼠(Soiled Bedding Sentinels, SBS)長(zhǎng)期以來應(yīng)用最為廣泛。但由于哨兵鼠方案本身存在的一些缺點(diǎn)，常常無法及時(shí)有效地監(jiān)測(cè)微生物污染的發(fā)生，且需要額外使用動(dòng)物，并不符合3R原則(詳見本號(hào)前期文章：哨兵鼠設(shè)置，你想知道的都在)。>>>商務(wù)洽談，點(diǎn)此處，在線咨詢

近幾年，國(guó)際上有越來越多的設(shè)施將環(huán)境樣本PCR檢測(cè)(Environmental Health Monitoring, EHM)作為哨兵鼠方案的補(bǔ)充或替代方案，以便更及時(shí)靈敏地監(jiān)測(cè)動(dòng)物(條件)致病微生物感染和攜帶狀況。我國(guó)也有少數(shù)設(shè)施采取這種監(jiān)測(cè)方案。該方案不僅提高了檢測(cè)的敏感性，還減少了動(dòng)物使用數(shù)量，同時(shí)在哨兵鼠設(shè)置和飼養(yǎng)上的時(shí)間和金錢成本也到了節(jié)省。隨著該方法的不斷優(yōu)化和普及，哨兵鼠方案在歐美多國(guó)有逐漸被取代的趨勢(shì)。本文就簡(jiǎn)要介紹一下EHM方案。

1 EHM方案的采樣方式

EHM方案最早采用無菌拭子擦拭附著在出風(fēng)口的粉塵(Exhaust Air Dust，EAD)，或用特定大小的紗布或?yàn)V紙固定在出風(fēng)口初效過濾器上收集粉塵。后來泰尼百斯、Allentown等籠具公司設(shè)計(jì)了專門的采樣口/卡槽并配套使用采樣卡，使得樣本采集更加簡(jiǎn)便，并標(biāo)準(zhǔn)化。這兩種方法都需要廢氣排出時(shí)不能在籠盒水平進(jìn)行空氣過濾。目前在美國(guó)、加拿大等國(guó)家這兩種方法都是被普遍使用的采樣方式。

近幾年，將植絨拭子、濾紙等介質(zhì)放入臟墊料盒中代替哨兵鼠，通過充分接觸可能存在的病原微生物進(jìn)行采樣的方法也被逐步采用。該方法不僅適用于所有設(shè)計(jì)形式的籠具同時(shí)還可有效避免由于籠架清洗不充分所殘留的核酸引起的假陽性結(jié)果。不論是使用哪種采樣方式，獲取的樣本都是用PCR方法檢測(cè)目標(biāo)病原體核酸，而由于PCR方法的高敏感性，因此足以檢測(cè)到樣本中的微量核酸。

Jensen, JAALAS, 2013

Miller, JAALAS, 2016

Mahabir, Lab Anim., 2018

Pettan-Brewer，JAALAS, 2020

Varela，JAALAS, 2022

2 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

在綜合分析了已公開發(fā)表的33篇文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，臟墊料哨兵鼠方案對(duì)各種病原體的總檢出率約76%，而EHM的檢出率約96%。(詳見表1)

目前小鼠肝炎病毒、小鼠細(xì)小病毒、仙臺(tái)病毒、嗜肺巴斯德桿菌、螺桿菌、鞭毛蟲、蟯蟲及螨蟲等多種病原體都已證實(shí)可在EAD樣本中準(zhǔn)確檢出。特別是其中有些病原體在臟墊料哨兵鼠方案會(huì)漏檢，但卻可以成功通過EHM檢測(cè)到，例如仙臺(tái)病毒、嗜肺巴斯德桿菌、螺桿菌、鼠阿米巴、蟯蟲等。但是也有一些病原體，尚未證實(shí)可以檢出，或不同研究顯示其檢測(cè)效果尚有爭(zhēng)議，例如輪狀病毒、鏈球菌等。

表1：不同病原體在臟墊料哨兵鼠和環(huán)境樣本中的檢出情況

*：檢出某病原體的文章數(shù)量/評(píng)估某病原體的文章數(shù)量

3 歐美實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施EHM使用情況

一項(xiàng)覆蓋美國(guó)、加拿大、歐洲、英國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的111個(gè)動(dòng)物設(shè)施的調(diào)查報(bào)告顯示，在大小鼠的月度和季度常規(guī)健康監(jiān)測(cè)中，有11%的設(shè)施單獨(dú)使用EHM，41%的設(shè)施單獨(dú)使用臟墊料哨兵鼠，46%的設(shè)施使用多種方案組合，此外有2%的設(shè)施不進(jìn)行常規(guī)健康監(jiān)測(cè)。對(duì)于檢疫期嚙齒類動(dòng)物，由于有更高的時(shí)效性要求，有更多人會(huì)選擇EHM方案，在被調(diào)查的111個(gè)設(shè)施中，63%的機(jī)構(gòu)單獨(dú)使用EHM，15%的設(shè)施單獨(dú)使用臟墊料哨兵鼠方案，14%的設(shè)施使用多種方法組合，還有8%的設(shè)施不檢測(cè)檢疫期動(dòng)物。

由以上數(shù)據(jù)可以看出，目前在檢疫檢測(cè)中，由于EHM可以更快反饋結(jié)果，因而使用更廣泛，但在常規(guī)健康監(jiān)測(cè)中用EHM將臟墊料哨兵鼠完全替代的還是少數(shù)。但業(yè)內(nèi)人士普遍相信，隨著越來越多的數(shù)據(jù)支持、廣泛的宣傳和專業(yè)指導(dǎo)，使用EHM方案的設(shè)施數(shù)量會(huì)越來越多。

4 實(shí)施EHM監(jiān)測(cè)前應(yīng)該評(píng)估的內(nèi)容

籠架和籠盒構(gòu)造可能是在實(shí)施EHM方案前最需要考慮的因素。如何采樣、采樣位置選擇將直接影響監(jiān)測(cè)效果，因此建議對(duì)于不同類型、不同廠家的籠具都應(yīng)該充分驗(yàn)證采樣時(shí)間、方式和位置后再正式使用。如果設(shè)施中曾經(jīng)發(fā)生過某種微生物污染，或所使用的墊飼料中殘留某種微生物的核酸，那籠架出風(fēng)口粉塵樣本中就很可能存在其核酸片段，這就會(huì)造成假陽性結(jié)果。例如，某設(shè)施在做驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)在用出風(fēng)口粉塵樣本檢測(cè)時(shí)可以檢測(cè)到大量綠膿桿菌核酸，但最終證實(shí)動(dòng)物并沒有感染，環(huán)境中也沒有活菌，而是所使用的飼料中存在綠膿桿菌核酸，這種混淆會(huì)耗費(fèi)大量精力和成本。

對(duì)于多數(shù)設(shè)施來說，使用哨兵鼠方案則可以通過購(gòu)買商業(yè)化試劑進(jìn)行自檢，但如果使用EHM方案，則需要進(jìn)行PCR自檢，那很可能由于方法驗(yàn)證不充分、實(shí)驗(yàn)室條件不適宜、氣溶膠污染等多種因素造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠。如果將EHM樣本送檢專業(yè)第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)，檢測(cè)成本則要明顯高于哨兵鼠檢測(cè)。盡管在哨兵鼠購(gòu)買、飼養(yǎng)、樣本采集等方面需要消耗更多資金和勞動(dòng)力成本，甚至經(jīng)過折算這部分成本是高于支出的檢測(cè)費(fèi)的，但相較于檢測(cè)費(fèi)，這些成本更為“隱形”。由于標(biāo)準(zhǔn)更新的周期漫長(zhǎng)，目前國(guó)標(biāo)GB/T 14926中檢測(cè)病原微生物的主要方法是血清學(xué)方法、培養(yǎng)法和鏡檢法，而極少提及分子生物學(xué)方法，這也使得不同實(shí)驗(yàn)室間方法不統(tǒng)一，使得其推廣應(yīng)用及不同機(jī)構(gòu)間互認(rèn)的阻礙增加。

5 展望

總而言之，目前在美國(guó)、加拿大、歐洲等國(guó)家和地區(qū)，EHM的驗(yàn)證和應(yīng)用越來越廣泛，已經(jīng)有少數(shù)設(shè)施完全取消了臟墊料哨兵鼠的使用，每年可減少數(shù)萬只哨兵動(dòng)物的使用。我國(guó)開展驗(yàn)證和應(yīng)用EHM方案的機(jī)構(gòu)數(shù)量還十分稀少，但是也逐漸有越來越多的設(shè)施管理者開始關(guān)注并嘗試。所以短期內(nèi)臟墊料哨兵鼠還是會(huì)被廣泛應(yīng)用，但是隨著管理人員對(duì)結(jié)果時(shí)效性、敏感性的要求的提高和方法的充分驗(yàn)證，EHM一定會(huì)被更多使用，并逐步替代哨兵鼠方案。

來源：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物那些事兒公眾號(hào)

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